1987年底，Robert Malone进行了一项里程碑式的实验，他将多股信使RNA与脂肪滴混合在一起，发现加入其中的人体细胞吸收了mRNA，并产生蛋白质。意识到这一发现可能在医学上具有深远的潜力后，加利福尼亚州拉霍亚索尔克生物研究所的研究生Malone后来记下了一些笔记，并在上面签名并注明了日期。
他在1988年1月11日写道，如果细胞能够从传递给它们的mRNA中产生蛋白质，那么“将RNA视为一种药物”是可能的。后来，Malone的实验表明青蛙胚胎能够吸收这种mRNA。这是第一次有人使用脂肪滴来简化mRNA进入生物体的过程。但通往成功的道路是曲折的。Malone的实验本身借鉴了其他研究人员的工作，许多年之后，人们认为mRNA太不稳定且价格昂贵，无法用作药物或疫苗。数十个学术实验室和公司致力于研究这个想法，努力寻找脂肪和核酸的正确配方——mRNA疫苗的基石。今天的mRNA疫苗的创新是在Malone在实验室工作数年后发明的，包括化学修饰的RNA和将它们注入细胞的不同类型的脂肪泡。尽管如此，自称为“mRNA疫苗发明者”的Malone认为他的工作没有得到足够的认可，“我已经被历史淘汰了，”他告诉《Nature》杂志。
随着诺贝尔奖的开始颁发，关于谁是这项技术的先驱的争论正在升温，随着下个月诺贝尔奖的宣布，猜测也越来越激烈。但仅限于少数科学家的正式奖项将无法认可mRNA医学发展的众多贡献者。实际上，通往mRNA疫苗的道路借鉴了数百名研究人员30多年的工作成果。
mRNA的起源
Malone的实验并非凭空而来。早在1978年，科学家们就使用称为脂质体的脂肪膜结构将mRNA转运到小鼠和人类细胞中以诱导蛋白质表达。脂质体包装并保护mRNA，然后与细胞膜融合，将遗传物质输送到细胞中。这些实验本身建立在脂质体和mRNA的多年工作基础上。两者都是在1960年代发现的（参见“mRNA疫苗的历史”，下图）。
然而，当时很少有研究人员将mRNA作为一种药物产品来考虑——尤其是因为还没有一种在实验室制造基因材料的方法。相反，他们希望用它来研究基本的分子过程。大多数科学家重新利用了兔血、培养的小鼠细胞或其他动物来源的mRNA。1984年，情况发生了变化，当时Krieg和马萨诸塞州剑桥市哈佛大学的发育生物学家Douglas Melton和分子生物学家Tom Maniatis和MichaelGreen领导的团队的其他成员使用RNA合成酶（取自病毒）和其他工具来生物生产实验室中的活性mRNA——一种至今仍在使用的核心方法。然后Krieg将实验室制造的mRNA注射到青蛙卵中，并表明它确实有用。Melton和Krieg都表示，他们主要将合成的mRNA作为研究基因功能和活性的研究工具。1987年，Melton发现mRNA可以用于激活和阻止蛋白质生产后，他帮助组建了一家名为Oligogen（后来在加利福尼亚州福斯特市更名为Gilead Sciences）的公司，探索使用合成RNA阻断目标基因表达的方法，以期治疗疾病。但他实验室的任何人或他们的合作者都没有想到疫苗。
Paul Krieg（左）和Douglas Melton（右）
他们在实验室研究合成mRNA的方法“总的来说，RNA以难以置信的不稳定性而闻名，”Krieg说，“RNA周围的一切都被小心翼翼地掩盖了”，这或许可以解释为什么哈佛大学技术开发办公室选择不为该组织的RNA合成方法申请专利。相反，哈佛大学的研究人员只是将他们的研究成果交给了Promega公司，这是一家位于威斯康星州麦迪逊的实验室用品公司，该公司为研究人员提供RNA合成工具。专利纠纷几年后，Malone遵循哈佛团队的策略合成了mRNA，但是他添加了一种新的脂质体——一种携带正电荷的脂质体，它增强了这种材料与带负电荷的mRNA骨架结合的能力。这些脂质体是由Philip Felgner开发的。
Philip Felgner(左)和Robert Malone
尽管Malone成功地使用脂质体将mRNA传递到人类细胞和青蛙胚胎中，但他未获得博士学位，他与他的导师Salk基因治疗研究员Inder Verma闹翻，并于1989年结束了研究生阶段，前往最近在加利福尼亚州圣地亚哥成立的初创公司Vical为Felgner工作。在那里，他们和威斯康星大学的合作者Madison的工作表明，脂质-mRNA复合物可以刺激小鼠的蛋白质生产。
Malone实验室笔记本的摘录，描述了1989年合成的mRNA注射到小鼠体内的过程后来事情变得一团糟。Vical（与威斯康星大学合作）和Salk于1989年3月开始申请专利。但Salk很快放弃了其专利主张，1990年，Verma加入了Vical的顾问委员会。Malone辩称，Verma和Vical达成了一项幕后交易，相关的知识产权归Vical所有。Malone被列为众多发明家之一，但他不再像从Salk颁发的任何专利中那样从随后的许可交易中获利。Malone的结论是：“他们靠我的思想成果发财。”Verma和Felgner断然否认Malone的指控。“这完全是胡说八道，”Verma告诉《自然》杂志，他说，放弃专利申请的决定取决于Salk公司的技术转让办公室。Malone于1989年8月离开Vical，理由是与Felgner在“科学判断”和“我的智力贡献的功劳”上存在分歧。他完成了医学院的学业并接受了一年的临床培训，然后在学术界工作，在那里他试图继续研究mRNA疫苗，但难以获得资金。（例如，1996年，他向加利福尼亚州的一家研究机构申请资金开发一种mRNA疫苗来对抗季节性冠状病毒感染，但没有成功。）最终，Malone专注于DNA疫苗和递送技术。2001年，他开始从事商业工作和咨询工作。在过去的几个月里，他开始公开抨击他的研究帮助实现的mRNA疫苗的安全性。例如，Malone说，疫苗产生的蛋白质会损害人体细胞，接种疫苗的风险大于对儿童和年轻人的好处——其他科学家和卫生官员一再反驳这种说法。
产品制造的挑战
1991年，Vical与世界上最大的疫苗开发商之一的美国默克公司达成了一项价值数百万美元的研究合作和许可协议。默克的科学家们评估了小鼠的mRNA技术，目的是创造一种流感疫苗，但后来放弃了这种方法。“制造的成本和可行性让我们停下了脚步，”前默克科学家Jeffrey Ulmer说。法国斯特拉斯堡一家名为Transgène的小型生物技术公司的研究人员也有同样的感受。1993年，Pierre Meulien领导的一个团队与工业界和学术界合作，首次证明脂质体中的mRNA可以在小鼠体内引发特异性抗病毒免疫反应。（另一项令人振奋的进展发生在1992年，当时斯克里普斯研究所的科学家使用mRNA替代老鼠体内的一种缺陷蛋白，以治疗代谢紊乱。但独立实验室报告类似的成功需要近二十年的时间。）Transgène研究人员为他们的发明申请了专利，并继续研究mRNA疫苗。但Meulien现在是创新药物计划（Innovative Medicines Initiative）的负责人，这是一家总部位于布鲁塞尔的公私营企业，他估计他至少需要1亿欧元（1.19亿美元）来优化这个平台——他不打算为这样一个“棘手、高风险”的企业向老板索要那么多钱，在Transgène的母公司决定停止支付维持其运作所需的费用后，该专利失效。
与默克团队一样，Meulien的团队转而专注于DNA疫苗和其他基于载体的递送系统。DNA平台最终产生了一些用于兽医应用的许可疫苗——例如，有助于预防养鱼场的感染。就在上个月，印度监管机构紧急批准了世界上第一种供人类使用的DNA疫苗，以帮助抵御COVID-19。但由于尚未完全了解的原因，DNA疫苗在人体中取得成功的速度很慢。Ulmer认为，尽管如此，业界围绕DNA技术的协同推进也为RNA疫苗带来了好处。从制造考虑和监管经验到序列设计和分子洞察力，“我们从DNA中学到的许多东西可以直接应用于RNA”，他说，“它为RNA的成功提供了基础。”
持续不断的斗争
在20世纪90年代和21世纪的大部分时间里，几乎所有考虑研究mRNA的疫苗公司都选择将其资源投资于其他领域。传统观点认为，mRNA太容易降解，其生产成本太高。“这是一场持续的斗争，”斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所的病毒学家Peter Liljeström说，他在30年前首创了一种“自我扩增”的RNA疫苗。1989年，Matt Winkler在得克萨斯州奥斯汀创立了第一家专注于RNA的实验室用品公司Ambion，他说：“RNA太难处理了”，“如果你（当时）问我你是否能把RNA注射到某人身上做疫苗，我会当面嘲笑你。”
mRNA疫苗的想法在肿瘤学界更受欢迎，尽管它是作为一种治疗剂，而不是预防疾病。从基因治疗师David Curiel的工作开始，几位学术科学家和初创公司探索了mRNA是否可用于对抗癌症。如果癌细胞表达mRNA编码的蛋白质，那么将其注射到体内可能会训练免疫系统攻击这些细胞。现在在密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院的Curiel在老鼠身上取得了一些成功的经验。但他说，当他就商业化机会与Ambion接洽时，该公司告诉他：“我们认为这项技术没有任何经济潜力。”另一位癌症免疫学家取得了更大的成功，并于1997年成立了第一家mRNA治疗公司。Eli Gilboa建议从血液中提取免疫细胞，并诱使它们提取编码肿瘤蛋白质的合成mRNA。然后，这些细胞被注射回体内，在那里它们可以调动免疫系统来攻击潜伏的肿瘤。Gilboa和他在北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心的同事在老鼠身上证明了这一点。
到20世纪90年代末，学术合作者已经开始了人体试验，Gilboa的商业分公司Merix Bioscience（后来更名为Argos Therapeutics，现在称为CoImmune）很快就开始了自己的临床研究。直到几年前，一种晚期候选疫苗在一项大型试验中失败后，这种方法才看起来很有希望。但Gilboa的工作产生了重要的影响，它激励了德国公司CureVac和BioNTech（当今最大的两家mRNA公司）的创始人开始研究mRNA。CureVac的Ingmar Hoerr和BioNTech的Uğur Şahin都告诉《自然》杂志，在了解Gilboa所做的事情后，他们想做同样的事情，是将mRNA直接注入体内。
Ingmar Hoerr（左）创立了CureVac，癌症免疫学家Eli Gilboa（右）创立了第一家mRNA治疗公司
启动加速器
Hoerr是第一个取得成功的人。2000年他在德国的Tübingen报告说，直接注射可以引起小鼠的免疫应答。那一年，他创建了CureVac（也总部设在Tübingen）。但似乎很少有科学家或投资者对此感兴趣。在一次Hoerr展示早期小鼠数据的会议上，他说，“有一位诺贝尔奖获得者站在第一排说，‘你在这里告诉我们的完全是狗屎——完全是狗屎’”（Hoerr拒绝透露诺贝尔奖获得者的姓名）。最终，资金慢慢流入。几年之内，人体试验开始了。
该公司当时的首席科学官Steve Pascolo是第一个研究对象：他给自己注射了mRNA，但腿上仍然有一块与头部相仿的白色疤痕，皮肤科医生在那里做了穿刺活检以进行分析。不久之后，一项更为正式的试验开始了，该试验涉及针对皮肤癌患者的肿瘤特异性mRNA。Şahin和他的免疫学家妻子Özlem Türeci也在20世纪90年代末开始研究mRNA，但比Hoerr等了更长的时间才创办公司。他们在德国美因茨约翰内斯·古腾堡大学工作多年，获得专利、论文和研究资助，然后在2007年向亿万富翁投资者推出商业计划。Şahin说：“如果成功，这将是一个突破”，他得到了1.5亿欧元的种子基金。Özlem Türeci和Uğur Şahin共同创立了mRNA疫苗公司BioNTech
同年，一家名为RNARx的新兴mRNA初创公司从美国政府获得了一笔资金：97396美元的小企业赠款。该公司创始人、生物化学家Katalin Karik和免疫学家Drew Weissman，当时都在费城宾夕法尼亚大学（UPENN）做了一些现在所说的关键发现：改变部分mRNA编码有助于合成mRNA通过细胞固有免疫防御。
一些基本见解
Karikó在整个20世纪90年代一直致力于将mRNA转化为药物平台，尽管拨款机构一直拒绝她的资助申请。1995年，在屡次遭到拒绝后，她本可以选择离开UPenn或接受降职和减薪，但她选择留下来继续她的不懈追求、对Malone的方案进行改进，并设法诱导细胞产生一种与治疗相关的大而复杂的蛋白质。Katalin Karikó帮助证明了对RNA的化学修饰可以使该分子免受人体的免疫防御
1997年，她开始与刚刚在宾夕法尼亚大学建立实验室的Weissman合作。他们计划共同开发一种基于mRNA的HIV/AIDS疫苗。但是当Karikó的mRNA被注射到小鼠体内时，它们会引发大规模的炎症反应。她和Weissman很快找到了原因：合成的mRNA激发了一系列被称为Toll样受体的免疫传感器，它们是病原体危险信号的第一反应器。2005年，两人报告说，重新排列mRNA的一个核苷酸尿苷上的化学键，以产生一种称为假尿苷的类似物，似乎可以阻止身体将其识别为敌人。当时很少有科学家认识到这些修饰核苷酸的治疗价值。但科学界很快意识到了它们的潜力。
2010年9月，由当时在马萨诸塞州波士顿儿童医院工作的干细胞生物学家Derrick Rossi领导的一个团队描述了如何利用修饰的mRNAs将皮肤细胞转化为胚胎样干细胞，然后转化为收缩的肌肉组织，这一发现引起了轰动。Rossi在《时代》杂志上被评为2010年“重要人物”之一，他与其他人在剑桥共同创立了一家公司Moderna。Moderna试图授权UPenn于2006年为Karikó和Weissman的发明申请的修饰mRNA专利，但为时已晚。在未能与RNARx达成许可协议后，宾夕法尼亚大学选择了快速支付。2010年2月，该公司（现在称为Cellscript）授予麦迪逊一家小型实验室试剂供应商独家专利权。它将继续从Moderna和BioNTech那里获得数亿美元的分许可费，这两家公司是第一批新冠病毒mRNA疫苗的创始者，产品均含有修饰的mRNA。与此同时，RNARx在2013年Karikó加入BioNTech（保留UPenn的附属任命）前后，又用光了80万美元的小企业赠款资金，并停止了运营。
Drew Weissman与Karikó合作，共同发现了修饰mRNA的优势
关于假尿苷的辩论。
研究人员仍在争论Karikó和Weissman的发现是否对成功的mRNA疫苗至关重要。Moderna一直使用经过修饰的mRNA——它的名字是这两个词的合成词，但该行业的其他一些人却没有。位于马萨诸塞州列克星敦的制药公司Shire的人类基因治疗部门的研究人员推断，如果添加正确的“cap”结构并去除所有杂质，未经修饰的mRNA可以产生同样有效的产品。“这取决于RNA的质量，”Michael Heartlein说，他领导了Shire的研究工作，并在剑桥的TranslateBio继续推进这项技术，Shire后来将其mRNA产品组合出售给了该公司。（Shire现在是日本武田公司的一部分）
尽管Translate有一些人类数据表明其mRNA不会引起令人担忧的免疫反应，但仍有待临床证明：其COVID-19候选疫苗仍处于早期人体试验阶段。法国制药巨头赛诺菲对这项技术的前景深信不疑：2021年8月，它宣布计划以32亿美元收购Translate。（Heartlein去年离开，在马萨诸塞州沃尔瑟姆成立了另一家公司，名为Maritime Therapeutics）与此同时，CureVac有自己的免疫缓解策略，包括改变mRNA的基因序列，以尽量减少其疫苗中尿苷的含量。20年的研究似乎取得了成果，该公司针对狂犬病和COVID-19的实验性疫苗的早期试验都证明是成功的。但在6月，来自后期试验的数据显示，CureVac的候选冠状病毒疫苗的保护性远远低于Moderna或BioNTech的疫苗。根据这些结果，一些mRNA专家现在认为假尿苷是该技术的一个重要组成部分，因此，他们认为卡里克和Weissman的发现是获得认可和奖励的关键促成性贡献之一。“
真正的赢家是修饰RNA，”Strand Therapeutics的联合创始人兼首席执行官Jake Becraft说，Strand Therapeutics是一家总部位于剑桥的合成生物学公司，致力于基于mRNA的疗法。不是每个人都这么肯定。苏州艾博生物科技有限公司（Suzhou Abogen Biosciences）首席执行官英博表示：“有多种因素可能会影响mRNA疫苗的安全性和有效性，mRNA的化学修饰只是其中之一”。该公司是一家中国公司，拥有一种针对新冠病毒-19的mRNA疫苗，目前正处于后期临床试验阶段。（该产品称为ARCoV，使用未经修饰的mRNA）
脂肪突破
至于关键技术，许多专家强调了另一项对mRNA疫苗至关重要的创新——一项与mRNA无关的创新。正是被称为脂质纳米颗粒或LNP的微小脂肪气泡保护了mRNA并将其运送到细胞中。这项技术来自加拿大温哥华不列颠哥伦比亚大学的生物化学家Pieter Cullis和他创立或领导的几家公司的实验室。
从1990年代后期开始，他们率先将LNP用于传递沉默基因活动的核酸链。一种这样的治疗方法patisiran现在被批准用于一种罕见的遗传性疾病。
在基因沉默疗法开始在临床试验中显示出前景之后，2012年，Cullis的两家公司转向探索LNP递送系统在基于mRNA的药物中的机会。例如，由首席执行官Thomas Madden领导的温哥华Acuitas Therapeutics与Weissman在宾夕法尼亚大学的团队以及几家mRNA公司建立了合作伙伴关系，以测试不同的mRNA-LNP制剂。现在可以在BioNTech和CureVac的COVID-19疫苗中找到其中一种。Moderna的LNP混合物与此没有太大不同。纳米粒子有四种脂肪分子的混合物：三种有助于结构和稳定性；第四种称为可电离脂质，是LNP成功的关键。这种物质在实验室条件下带正电荷，与1980年代后期Felgner开发和Malone测试的脂质体具有相似的优势。
但是，Cullis和他的商业伙伴提出的可电离脂质在生理条件下（例如血液中的条件）转化为中性电荷，这限制了对身体的毒性作用。此外，与Cullis有关联的几家企业的前高管Ian MacLachlan表示，这种四脂鸡尾酒可以让产品在药房货架上存放更长时间，并保持其在体内的稳定性。他说：“正是这一整套的药具和材料导致了我们现在拥有的药理学”。
到2000年代中期，一种混合和制造这些纳米颗粒的新方法已经被设计出来。它涉及到使用“T型连接器”装置，将脂肪（溶解在酒精中）与核酸（溶解在酸性缓冲液中）结合起来。当两种溶液流合并时，组分自发形成密集的LNP。事实证明，它是一种比其他制造基于mRNA的药物的方法更可靠的技术。圣地亚哥Replicate Bioscience的现任首席开发官Andrew Geall表示，一旦所有的部分组合在一起，“就像天方夜谭，我们终于有了一个可以扩展的过程”。Geall于2012年在诺华在剑桥的美国中心领导了第一个将LNP与RNA疫苗相结合的团队。现在每个mRNA公司都使用这种LNP递送平台和制造系统的一些变体——尽管谁拥有相关专利仍然是法律纠纷的主题。例如，Moderna与Cullis的一家附属企业——温哥华的Arbutus Biopharma——就谁拥有Moderna的COVID-19疫苗中发现的LNP技术的权利展开了一场斗争。
一个行业的诞生
到2000年代后期，几家大型制药公司开始进军mRNA领域。例如，2008年，Novartis和Shire都成立了mRNA研究部门——前者（由Geall领导）专注于疫苗，后者（由Heartlein领导）专注于治疗。2012年，美国国防高级研究计划署（Defense Advanced Research Projects Agency）决定开始资助行业研究人员研究RNA疫苗和药物，这一决定推动了BioNTech的成立，其他初创企业也很快加入了竞争。Moderna是建立在这项工作基础上的公司之一，到2015年，它已经筹集了超过10亿美元，承诺利用mRNA诱导体内细胞制造自己的药物，从而修复蛋白质缺失或缺陷引起的疾病。当该计划失败时，由首席执行官Stéphane Bancel领导的Moderna选择优先考虑生产疫苗。
这最初让许多投资者和旁观者感到失望，因为疫苗平台似乎不那么具有变革性，也不那么有利可图。到2020年初，Moderna已经将九种候选的感染性疾病的mRNA疫苗送入人体进行测试，但没有一次扣篮成功，只有一个进入了更大的试验阶段。但当新冠病毒爆发时，Moderna很快就脱颖而出，在病毒基因组序列上线后的几天内就制造出了一种原型疫苗。该公司随后与美国国家过敏和传染病研究所（NIAID）合作，在不到十周的时间内进行了小鼠研究和人体试验。BioNTech也采取了全副武装的方法。
2020年3月，该公司与总部位于纽约的辉瑞制药公司（Pfizer）合作，随后临床试验以创纪录的速度进行，在不到8个月的时间内从首次人体试验到紧急批准。两种授权疫苗都使用在LNP中配制的修饰mRNA。两者还包含编码一种形式的SARS-CoV-2刺突蛋白的序列，该蛋白采用更适合诱导保护性免疫的形状。许多专家表示，由NIAID疫苗学家Barney Graham和德克萨斯大学奥斯汀分校的结构生物学家Jason McLellan和斯克里普斯的Andrew Ward设计的蛋白质调整也是一项有价值的贡献，尽管它是冠状病毒疫苗特有的，而不是作为一般平台的mRNA疫苗。
在讨论mRNA发现的功劳时，有些人的愤怒与谁拥有有利可图的专利有关。但大部分基础知识产权可以追溯到1989年Felgner、Malone和他们在Vical的同事（以及1990年Liljeström）提出的权利主张。这些文件自发布之日起只有17年的有效期，因此现在已公开。即使是在2006年获得Cellscript许可并提交的Karikó-Weissman专利，也将在未来五年内到期。业内人士表示，这意味着很快就很难获得关于在脂质纳米颗粒中传递mRNA的广泛主张的专利，尽管公司可以合理地为特定的mRNA序列（例如刺突蛋白的一种形式）或专有的脂质制剂申请专利。企业正在努力。Moderna是mRNA疫苗领域的主要参与者，该公司在流感、巨细胞病毒和一系列其他传染病的临床测试中进行了实验性注射，去年获得了两项专利，涉及广泛使用mRNA来生产分泌蛋白。
但多位业内人士告诉《自然》，他们认为这些可能具有挑战性。加拿大卡尔加里的mRNA疫苗公司Providence Therapeutics的首席科学官Eric Marcusson说：“我们不认为有很多是可以申请专利的，当然也不能强制执行”。
By Jeff